بهبود پورتال

اثر گالیم بر پارامترهای بیلیروبین و آمینوترانسفرازها در موش صحرایی

مژگان قاری پور* ؛ دکتر سید علی اصغر مشتاقی** ؛ دکتر احمد موحدیان **؛ دکتر بابک ثابت***

چکیده :

سابقه و هدف: عنصر گالیم در تصویربرداری پزشکی و شیمی درمانی مورد استفاده قرارمی‌گیرد. ازآنجا که تجمع گالیم در کبد به اثبات رسیده است و هنوز گزارشی مبنی بر تأثیر گالیم در پارامترهای فعالیت کبدی از جمله آمینوترانسفرازها و بیلیروبین موجودنیست، مطالعةحاضر برای‌یافتن چگونگی‌تأثیرات‌گالیم در درازمدت و بررسی‌مکانیسم آن‌طراحی‌شده‌است.

مواد و روش‌ها:مطالعه به شیوه تجربی از نوع شاهددار انجام گرفت. 7 گروه 5 تایی موش صحرایی انتخاب شدند و پس از تزریق داخل صفاقی گالیم در دوزهای 5، 10و mg/kg.B.W 15 ( به مدت 30 و 60 روز) نمونه‌گیری انجام شد و مقادیر بیلیروبین و آمینوترانسفرازها مورد بررسی قرار گرفتند.

یافته‌ها: نتایج به‌دست‌آمده پس از 30 روز تیمار حاکی از افزایش فعالیت آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) در گروه mg/kg.B.W 15 به مقدار 66/44% و افزایش فعالیت آلانین آمینوترانسفراز (ALT) درهمین گروه به‌میزان 38/12% بود. بیلیروبین کل  73/2برابر و بیلیروبین مستقیم 26/2 برابر افزایش یافت. مصرف گالیم به مدت60 روز سبب افزایش فعالیت آنزیم آسپارتات‌آمینوترانسفراز دراین گروه به میزان 3برابر و فعالیت آنزیم آلانین آمینوترانسفراز به‌مقدار 6برابر نسبت به گروه شاهد شد. بیلیروبین کل نیز درگروه آزمایش 60 روزه  9برابر افزایش پیدا کرد. این نتایج در  05/0P< معنا‌دار است.

بحث: گالیم با تجمع در سلول‌های کبدی و اتصال به گروه  سولفهیدریل پمپ سدیم پتاسیم سبب مهار ترشح و انتقال بیلیروبین به مجاری صفراوی می‌شود. با باقی‌ماندن بیلیروبین در فضای داخلی غشاها، از آنجا که نقش دترجنت را ایفا می‌کند، باتخریب غشای سلولی سبب رهاشدن آمینوترانسفرازها به داخل سرم می‌گردد. نتایج به‌دست‌آمده نشان داده که میزان فعالیت آنزیم AST حداکثر تا 3برابر نسبت به گروه شاهد افزایش یافته است. با ادامة مصرف گالیم علاوه بر غشای سلولی، غشای میتوکندری نیز تخریب  و آلانین آمینوترانسفراز  به داخل سرم رها گردیدکه افزایش فعالیت آنزیم ALT  تا
حدود 6برابر نسبت به گروه شاهد مشاهده شد. با عدم انتقال بیلیروبین به صفرا، میزان سرمی این پارامتر نیز در حد قابل‌ملاحظه‌ای افزایش یافت. نتایج این پژوهش نشان داد که مقدار بیلیروبین کل تا 9برابر افزایش داشته است که ناشی از عدم انتقال بیلیروبین به صفرا می‌باشد. باتوجه به اینکه گالیم تغییرات معناداری در شاخص‌های عملکرد کبدی به‌وجود می‌آورد توصیه می‌شود که در مصرف درمانی گالیم در بیماری‌های بدخیم علاوه بر رعایت دوز دارو به مدت زمان تیمار نیز توجه شود.

کلیدواژه‌ها: گالیم، بیلیروبین، آمینوترانسفرازها، موش صحرایی.

* فوق لیسانس بیوشیمی بالینی، مرکز تحقیقات قلب و عروق اصفهان، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان.

** PhD بیوشیمی بالینی و عضو هیأت علمی گروه بیوشیمی، دانشکدة داروسازی و علوم دارویی و دانشگاه علوم پزشکی اصفهان.

*** پزشک عمومی.

_* عهده دار مکاتبات: اصفهان، مرکز تحقیقات قلب و عروق اصفهان، تلفن: 4460807-0311

مقدمه:

امروزه‌گالیم، به‌عنوان‌عنصری با خواص سیتوتوکسیک در درمان انواع تومورها از جمله تومورهای اوروتلیال، ریه، کولون، پستان و ... کاربرد دارد (1). از سوی دیگر، این عنصر در شکل رادیواکتیو برای اسکن‌کردن استخوان‌ها و تومورها مورد استفاده قرار‌می‌گیرد(2). گالیم به‌صورت ترکیب با نمک‌های مختلف از جمله کلراید، سیترات و نیترات مصرف‌می‌گردد. در مطالعات انجام‌شده نشان‌داده‌شده که گالیم از طریق روده‌ای به‌صورت انتقال  غیرفعال (بدون صرف انرژی) جذب و آنگاه به پروتئین‌های ناقل پلاسمایی از جمله سیدروفورها، لاکتوفرین و ترانسفرین متصل می‌گردد(3و4) که این اتصال تا زمان اشباع‌شدن پروتئین‌های مذکور ادامه می‌یابد. سپس کمپلکس پروتئین_-گالیم با واسطه رسپتور سلولی وارد سلول می‌گردد. در مطالعات نشان‌داده شده که گالیم پس از ورود به سلول به‌ترتیب در لیزوزم‌ها، هسته و میتوکندری سلول‌های بافت نرمال و سرطانی جای می‌گیرد(5). نوع نمک در برداشت گالیم مؤثراست(6). مشخص شده که پس از پلاسما، کبد دومین بافت مورد انتخاب گالیم می‌باشد (7). گالیم پس از ورود به سلول سبب تداخل در متابولیسم آهن می‌شود(8) و از سوی دیگر، با تأثیر در آنزیم ریبونوکلئوتیدردوکتاز سبب مهار پرولیفراسیون سلول‌ها می‌گردد(9). گالیم با تمایل به‌اتصال به گروه سولفهیدریل(SH-) پروتئین‌ها می‌تواند سبب توقف بسیاری از مکانیسم‌های انتقالی گردد (10). باتوجه به تمایل گالیم به تجمع در سلول‌های کبدی و اثر افزاینده‌ای که بر مقادیر سرمی آلکالن فسفاتاز کبدی دارد(11)، در مطالعة حاضر اثر گالیم بر بیلیروبین و آمینوترانسفرازها که ازجمله شاخص‌های عملکردکبدی هستند، بررسی می‌شود. دراین مطالعه سعی‌شده‌است مکانیسم مناسبی از نحوه تأثیرگالیم در سلول کبدی ارائه گردد.

 مواد و روش‌ها:

   این مطالعه از نوع تجربی شاهددار می‌باشد که در آن از موش‌های صحرایی نر (Rat) بانام علمی  Rattus Norvegicous Allivius از نژاد Wistar استفاده‌شده‌است. حیوانات از انستیتوپاستور تهران خریداری و در اطاق‌حیوانات تحت شرایط استاندارد از لحاظ نور وحرارت و تغذیه نگهداری شدند. گالیم به فرم نمک نیترات گالیم ازکارخانه سیگمای آلمان تهیه گشت ومحلول نیترات گالیم درسرم فیزیولوژی باغلظتmg/kg 100 (دوزLD₅₀) تهیه و سپس دوزهای مختلف از آن ساخته شد و به صورت داخل صفاقی در دورة بلندمدت 30 و60 روزه به مقادیر 10،5وmg/kg.B.W15 (به‌صورت یک روز در میان) تزریق گردید. در گروه شاهد فقط از سرم فیزیولوژی ml/kg 8/0 استفاده شد. حجم نهایی تزریق در کلیه گروه‌ها ml2/0 بود. تعداد موش‌ها باتوجه به‌مطالعات قبلی در گروه‌های شاهد و مورد آزمایش 5 سر بود. پس از پایان تزریقات، حیوانات با اتر بیهوش شدند و خون از طریق زدن شاهرگ جمع‌آوری گشت. بعد از لخته‌شدن خون، سرم آن توسط سانتریفوژ جدا شد و برای اندازه‌گیری پارامترهای بیوشیمیایی مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آمینوترانسفرازها و میزان انواع بیلیروبین با شیوة اسپکتروفتومتری به وسیله  دستگاه Perkin–Elmier UV/Vis ساخت آلمان اندازه‌گیری شد(12و13). میانگین مقادیر به‌دست‌آمده در گروه شاهد و گروه‌های مورد آزمایش با کمک آزمون آنالیز واریانس (ANOVA) با پس‌آزمون Tukey HSD مقایسه شد و از لحاظ آماری 05/0P< معنادار تلقی‌گردید.

یافته‌ها:

مصرف گالیم در مقادیر 10،5وmg/kg.B.W 15 به مدت 30 روز به‌ترتیب سبب17% کاهش و 95/1% و 66/40% افزایش فعالیت آسپارتات آمینوترانسفراز گردید و به مدت 60 روز به‌ترتیب سبب 20/5%،
69/1برابر و 01/3برابر  افزایش فعالیت آنزیم نسبت به گروه شاهد شد. مصرف گالیم در مقادیر10،5 وmg/kg.B.W15 به مدت 30 روز به ترتیب سبب
88/0، 88/3 و 38/12 درصد افزایش فعالیت آلانین آمینوترانسفراز و مصرف همین مقادیر از گالیم به مدت 60 روز سبب 77/41%، 16/1برابر و 95/5برابر افزایش فعالیت آنزیم مذکور گردید (05/0P<)
(جدول 1).

جدول1- مطالعه اثرات درازمدت گالیم بر مقادیر آسپارتات آمینوتراسفراز و آلانین آمینو ترانسفراز.

* 05/0P<

جدول2- مطالعه اثرات درازمدت گالیم بر مقادیر بیلیروبین توتال و مستقیم سرمی.

* 05/0P<

     تزریق گالیم در مقادیر مذکور به مدت 30 روز سبب‌افزایش بیلیروبین کل به‌میزان 66/53%، 87/1برابر و 73/2 برابر گردید و پس از60 روز تیمار نیز به مقدار 21/2برابر ، 55/8برابر و 9برابر افزایش بیلیروبین کل مشاهده شد(05/0P<). در گروه آزمایش 30روزه با تزریق گالیم به‌مقادیر 5، 10و mg/kg.B.W15 به‌ترتیب 17/29%، 55/80% و 26/2برابر افزایش بیلیروبین مستقیم مشاهده شد و درگروه آزمایش 60 روزه نیز به‌ازای تزریق همین مقادیر گالیم به‌ترتیب 04/1برابر، 35/3برابر و17/4برابر افزایش بیلیروبین مستقیم مشاهده گردید(05/0P<) (جدول 2).

بحث:

  این مطالعه نشان‌داد که گالیم سبب افزایش مقادیرسرمی آمینوترانسفرازها و نیز انواع بیلیروبین می‌شود. نتایج Mathovic و همکارانش نیز درسال 1990 افزایش آلکالن‌فسفاتاز سرمی را گزارش نمودند(14). مطالعة قبلی ما نیز افزایش آلکالن فسفاتاز سرمی را با منشأ کبدی تأیید کرد(11). هنوز گزارشی مبنی بر نتیجة اثر گالیم بر فاکتورهای کبدی ارائه نشده است. مطالعات انجام شده نشان می‌دهند که عناصر مختلف می‌توانند با اتصال به بیومولکول‌ها و یا به علت شباهت ساختمانی با عناصر کمیاب ضروری با جانشین‌شدن به جای آن‌ها، مسیرهای متابولیسمی مربوطه را مختل‌نمایند(15). مکانیسم جایگزینی گالیم در بافت به این صورت است که پس از ورود به بدن با عبور از میان غشای اپی‌تلیال روده توسط پروتئین‌های ناقل انتقال و در بافت‌هایی که واجد رسپتورهای اختصاصی بیشتری برای این پروتئین‌های ناقل از جمله ترانسفرین و سیدروفورها هستند، تجمع‌می‌یابد(16). هپاتوسیت‌های کبدی باتوجه به تراکم بالای رسپتورهای ترانسفرینی در سطح  خود یکی از مناطق تراکم گالیم محسوب می‌شوند(17و18). مطالعات جدید ترانسفرین را در برداشت گالیم از روده مؤثر می‌دانند، اما عقیده بر این‌است که در ورود گالیم به هپاتوسیت نقشی ندارد. گالیم پس از ورود به بافت ابتدا در ماتریکس خارج سلولی و سپس در داخل سلول انباشته می‌شود. وجود آهن سه‌ظرفیتی در خون باعث کاهش برداشت گالیم توسط هپاتوسیت‌ها می‌گردد
(19). مهم‌ترین اثر سلولی آن مهار فعالیت آنزیم ریبونوکلئوتید ردوکتاز است که باعث کاهش پرولیفراسیون سلولی می‌شود(20) مطالعات دیگر نیز اثرتخریبی نیترات گالیم را بر کبد نشان داده‌اند(21). گالیم از طریق ترانسفرین انتقال می‌یابد و با اتصال به گروه‌های سولفهیدریلی SH– پمپ سدیم‌پتاسیم، عملکرد این پمپ را در سلول کبدی مختل می‌نماید
(10). احتمالاً با این مکانیسم انتقال صفرا بلوکه می‌گردد. با باقی‌ماندن صفرا در فضای کانالیکولار، غشای هپاتوسیت به علت اثر دترجنتی صفرا تخریب و نهایتاً منجر به افزایش آلانین‌آمینوترانسفراز در سرم می‌شود. باادامة‌مجاورت  صفرا، غشای میتوکندری نیز دچار نشت‌شده، مقادیر افزوده‌ای از آسپارتات آمینوترانسفراز از منابع سیتوزولی و میتوکندریایی به سرم رها می‌گردد. نتایج ما نشان‌داده‌است که در دورة 30 روزه میزان فعالیت آسپارتات آمینوترانسفراز در گروه‌های 5 وmg/kg.B.W10 نسبت به گروه شاهد تفاوت معناداری نداشته‌است، در حالی‌که مصرفmg/kg.B.W15 سبب 4/0برابر افزایش فعالیت آنزیم گردید. در دورة 60 روزه در مقادیر 10،5وmg/kg.B.W15 وزن بدن به‌ترتیب 05/0،69/1 و
01/3 برابر افزایش فعالیت آنزیم مذکور دیده شد. آلانین آمینوترانسفراز نیزدرهمین گروه‌ها در دورة 60 روزه  به‌ترتیب سبب 41/0، 16/1 و 95/5 برابر افزایش مقادیر آنزیم سرمی گردید. آنچه دارای  اهمیت ویژه است این نکته است که درمورد آنزیم‌های موردبحث، دوز حداقل یا mg/kg 5 در مدت 30 روز فاقد تأثیر معنا‌دار بوده، در صورتی‌که درمان با همین دوز در دورة 60 روزه باعث افزایش معنادار فعالیت آنزیم شده است. همچنان‌که مشاهده می‌شود با افزایش زمان تیمار با گالیم، اگرچه دوز مصرفی بدون تغییر بوده، ولی مقادیر آنزیم‌های آسپارتات آمینوترانسفراز و آلانین آمینوترانسفراز در سرم افزایش یافته که در حقیقت اثر تجمعی گالیم را نشان‌می‌دهد. مطالعات قبلی حداقل تأثیرات جانبی و حداکثر اثر درمانی نیترات گالیم را در دوز حداقل برای درمان بیماری پاژه نشان داده‌اند(19). مقایسة دوز مصرفی mg/kg.B.W10 نیز تأثیرات تجمعی گالیم را تأیید می‌کند. با  ثابت نگه‌داشتن دارو و دوبرابرکردن  زمان تیمار، آنزیم‌های  ذکرشده به‌صورت تصاعد هندسی افزایش می‌یابند. دوز mg/kg.B.W15 نیز همین نکته را تأیید می‌کند. مطالعة ما نشان می‌دهد که نکتة مهم در مصرف درمانی گالیم در بیماری‌های بدخیم علاوه بر رعایت دوز دارو، توجه به مدت زمان تیمار نیز می‌باشد. از سوی دیگر صفرا با تأثیرمیتوژنی خویش سبب تغییرشکل هپاتوسیت به سلول صفراوی می‌شود که افزایش بیلیروبین و افزایش ساخت آلکالن فسفاتاز را به همراه دارد(22). در مطالعه ما مشخص شد که بیلیروبین کل تا حداکثر 9برابر و بیلیروبین مستقیم نیز تا 17/4برابر افزایش می‌یابد و تغییرات بیلیروبین توتال و بیلیروبین مستقیم در کلیه گروه‌ها معنادار است. نتایج این مطالعة نشان داد که گالیم می‌تواند تغییرات معنا‌دار در مقادیر شاخص‌های عملکرد کبدی به وجود آورد. پیشنهادمی‌شود برای یافتن مکانیسم اختصاصی، تأثیر گالیم در هپاتوسیت‌ها تحت شرایط “In Vitro” موردمطالعه قرار گیرد.