بهبود پورتال

شناسایی و تعیین مقدار فنل گلیکوزید آربوتین در برگ گیاه

Pyrus boissieriana Buhse به دو روش

HPLC و اسپکتروفتومتری

محمد آزادبخت *(Ph.D.)            محمد رمضانی **(Ph.D.)             مریم جهرمی مقدم ***(Ph.D.)

چکیده

سابقه و هدف : درخت تلکا (Pyrus boissieriana Buhse) که به گلابی وحشی نیز موسوم است، در جنگل های شمال ایران، به فراوانی، یافت می شود و از جلگه های ساحلی تا ارتفاعات زیاد، پراکنده است. دمگل، برگ‌ها و پوست برخی از گیاهان جنس Pyrus حاوی مقادیری از یک فنل گلیکوزید به نام آربوتین می باشد. آربوتین در مقادیر بالا در بسیاری از گیاهان از جمله تیره های Ericaceae|Rosaceae و... یافت می شود. از آربوتین برای ضدعفونی کردن مجاری ادراری ونیز به واسطه اثر آنتی اکسیدان و ضد آفتاب، استفاده می کنند.این ماده، دیورتیک و قاعده آور است.

مواد و روش ها : در این مطالعه، شناسایی آربوتین در برگ گیاه تلکا به دو روش HPLC  وTLC صورت گرفت و سپس میزان آربوتین توسط روش‌های HPLC و اسپکتروفتومتری تعیین شد.

یافته‌ها : آربوتین منشا گیاهی داشته و دربرگ برخی از گیاهان از جمله Arctostaphylos uva-ursi 4 تا 15 درصد، Vaccinium vitis 5/5 تا 7 درصد و Vaccinium myrtillus 4/0 تا 5/1 درصد یافت می‌شود. در این تحقیق، میزان آربوتین 01/7 درصد به دست آمد و زمان بازداری آربوتین و زمان بازداری نسبی آن در مقایسه با هیدروکینون (استاندارد داخلی) به ترتیب 457/5 و 688/0 بود.

استنتاج : گیاهان uva-ursi  A. و V. vitis در ایران وجود ندارند؛ بنابر این گیاه تلکا با توجه به مقدار بالای آربوتین و همچنین فراوانی و پراکندگی زیاد آن در شمال ایران می تواند به عنوان منبع غنی آربوتین مورد استفاده قرار گیرد.

واژه های کلیدی : فنل‌ها، گلیکوزیدها، مجرای ادراری، گیاهان شفابخش

مقدمه

درخت تلکا با نام علمی Pyrus boissieriana Buhse که به گلابی وحشی نیز موسوم است، در جنگل‌های شمال ایران از ارسباران و آستارا تا گرگان پراکنده است و از جلگه های ساحلی دریا تا ارتفاعات زیاد، بالا می‌رود. ارتفاع این درخت، 5 متر است. برگ آن تخم‌مرغی گـرد با انتهـایی‌کنـد است، ولـی این انتهـا در

* دکترای تخصصی فارماکوگنوزی| دانشیار دانشگاه علوم پزشکی مازندران                    * ساری: خیابان سلمان فارسی- دانشکده داروسازی

** دانشیار دانشگاه علوم پزشکی مشهد                                        *** دکتر داروساز

Eتاریخ دریافت: 14/12/81           تاریخ ارجاع جهت اصلاحات: 2/4/82           تاریخ تصویب: 9/7/82

برگ‌های جوان، کمی کشیده است. روی برگ، صاف و براق است ودارای رنگ سبز روشن می باشد. میوه آن کوچک،گردوکمی‌گلابی‌شکل است(1). دمگل،برگ‌ها و پوست برخی از گیاهان جنس Pyrus حاوی مقادیری از یک فنل گلیکوزید به نام آربوتین1 است(2).

آربوتین(آربوتوزید) یک هیدروکینون گلوکوزید است که در مقادیر بالا در بسیاری از گیاهان از جمله تیره‌های Ericaceae|Rosaceae و... یافت می‌شود(3). محتوای آربوتین در برگ برخی از گیاهان جنس Pyrus با تغییرکوچکی از زمان گل دادن تا زمان افتادن برگ‌ها ثابت است(2). بهترین زمان برای دستیابی به مقادیر بیش‌تر آربوتین از برگ‌های برخی از گیاهان جنس Pyrus فصل بهار و از برگ‌های سبز وجوان می باشد. فرمول ساختار آن C₁₂ H₁₆ O₇باوزن مولکولی 25/272 می باشد و در طول موج 286 nm حداکثر جذب را در برابر اشعه فرابنفش دارا می‌باشد. آربوتین در گرما ناپایدار است و می تواند به شکل‌های مختلفی تجزیه شود(4).

تصویر شماره 1 : ساختمان شیمیایی آربوتین

از آربوتین برای ضدعفونی کردن مجاری ادراری در عفونت‌های دستگاه ادراری و به عنوان پایدارکننده درفیلم‌های عکاسی استفاده می‌شود. نیز اثر آنتی‌اکسیدان و ضد آفتاب دارد و به عنوان عامل سفید کننده2 در فرمولاسیون اشکال دارویی موضعی محافظ در برابر تابش‌‌های شدید اشعه فرابنفش به کار برده می شود. آربوتین برای چشم و پوست، حساسیت زا نمی‌باشد(4).

آربوتین قاعده آور ودیورتیک است.میوه های تازه جنس Pyrus در انسان درمصرف خوراکی، فعالیت ضدتوموری وفعالیت ضدجهش ژنی در برابر باکتری سالمونلاتیفی موریوم نشان داده اند(5).

مواد و روش ها

الف) مواد (ساخت Merck): متانول، پتاسیم هگزا سیانو فرات3، استاندارد آربوتین، کلرید آهن 3،4-آمینو آنتی پیرین ، آمونیاک ، کلروفرم و اتیل استات.

دستگاه‌های مورد استفاده: اسپکتروفتومتر (مدل دستگاه: Genesis2 ساخت: آلمان طول موج مریی استفاده شده: 455 nm) ، دستگاه Rotary Evaporator (نام دستگاه روتاری:Laborata 4000 ، ساخت:آلمان، دمای استفاده شده: 50 درجه سانتی گراد، دور چرخش: 90 دور در دقیقه) ، دستگاه Freeze drying (مدل دستگاه:Zirbus ، ساخت: آلمان، دمای استفاده شده : 52- درجه سانتی‌گراد) ، لامپ فرابخش (نام دستگاه: Desaga ، ساخت : آلمان ، طول موج استفاده شده:

254 nm)، دستگاه HPLC(مدل دستگاه‌ها:Knauer و Shimadzue ، ســاخت: آلمــان و ژاپـن (به تـرتیب)، UV Detector K-2600 ،HPLC Pump K-1001 ، فاز متحرک: متانول، آب (90:10)، نوع ستون: Eurospher-C₁₈، سایز ستون : 25سانتی متر ، طول موج فرابنفش به کــار رفتــه : 286 nm ، روش کــار: ایــزوکراتیــک، flow rate: 1  ml/ min) (6).

ب) تهیه گیاه و تایید علمی: در اردیبهشت ماه سال 1381 برگ‌های درخت تلکا از ارتفاعات 1200 متری جنگل‌های نکا در استان مازندران جمع آوری شد ونام علمی آن مورد تایید قرارگرفت وهرباریوم آن درواحد فارماکوگنوزی دانشکده داروسازی ساری تهیه شد.

ج) روش تهیه عصاره: 10 گرم پودر برگ درخت تلکا با اندازه ذره‌ای حدود25/0 میلی متر با حلال متانول خالص به مدت 4 ساعت سوکسله شد و عصاره حاصل توسط دستگاه Rotary evaporator تغلیظ گردید.

د) روش شناسایی: شناسایی توسط HPLC 1 و TLC 2 صورت گرفت. در روش TLC ، 1 گرم عصاره در 1 میلی لیتر متانول حل شده و 25 میکرولیتر آن روی صفحه TLC کاشته شد. در کنار این لکه ، لکه ای از نمونه استاندارد آربوتین (1/0 گرم آربوتین در 1 میلی لیتر متانول حل شد) به میزان 25 میکرولیتر کاشته شدو در مخزن اشباع حاوی فازمتحرک اتیل استات، متانول وآب (100: 5/13 : 10 ) قرار داده شد . در زیر اشعه فرابنفش دو لکه مشاهده شد . با اسپری کردن معرف برلین بلو( پتاسیم هگزاسیانو فرات3 و کلرید آهن3) دو لکه آبی مشاهده شد(7).

در روش HPLC ، زمان بازداری آربوتین (RT  3 ) در تزریق 20 میکرولیتر محلول استاندارد آربوتین و سطح زیرمنحنی آن تعیین شد. سپس 20 میکرولیتر محلول عصاره گیاه به دستگاه ‌HPLC تزریق شد. جهت اطمینان، 20 میکرولیتر از محلول عصاره حاوی استاندارد آربوتین (اضافه شده به صورت Additional standard) به دستگاه تزریق گردید که منجر به بزرگ شدن پیک مربوط به آربوتین شد.

یافته‌‌ها

ب ) در تصاویر شماره‌های 4 و3 و2 نمونه هایی از پیک‌های مربوط به منحنی HPLC محلول‌های استاندارد آربوتین ( به همراه استاندارد داخلی)، عصاره حاوی استاندارد آربوتین و عصاره گیاه (به همراه استاندارد داخلی) جهت شناسایی، مشاهده می‌شود. در تصویر شماره 2 زمان بازداری‌های 586/2، 438/5 و890/7 به ترتیب مربوط به حلال، استاندارد آربوتین وهیدروکینون (استاندارد داخلی) هستند.

شرایطHPLC  :نوع ستون:C₁₈ Eurospher 100-، فاز متحرک:متانول ، آب (10 :90 )، اندازه ذره‌ای :5میکرومتر، دتکتور: فرابنفش، طول موج به کار رفته: 286 nm، سایز ستون:25 سانتی متری، روش کار: ایزوکراتیک سرعت جریان: ml/min1 ،2/0 A.U.F.S= در نمودار شماره 1و3 دستگاه مورد استفاده Knauer است، اما در نمودار شماره 2 دستگاه مورد استفاده Shimadzue با سرعت جریان  ml/min5/0 است.

ج) در جدول شماره 1 نتایج HPLC مربوط به میانگین سه‌آزمایش انجام شده برای هریک از نمونه‌های استاندارد آربوتین (با استاندارد داخلی) ، عصاره گیاه (با استاندارد داخلی)و نیز درنمودارشماره4 منحنی‌استاندارد آربوتین (با استاندارد داخلی) آورده شده است.

جدول شماره 1 : نتایج آنالیز عصاره برگ تلکا و استانداردها به روش HPLC

نمودار شماره 4 : منحنی استاندارد میانگین نمونه های استاندارد آربوتین(با استاندارد داخلی) در3 بارتزریق

د) مقدار آربوتین در عصاره گیاه :پیک  عصاره رقیق شده| غلظتی معادل  4477/418ppm  (4477/418 میلی گرم در 1000 میلی لیتر) را نشان داد. بنابراین  در 25 میلی لیتر محلول آماده شده| معادل 461/10 میلی گرم خواهد بود.

از آنجایی که 3/0 میلی لیتر محلول عصاره با 25 میلی لیتر| رقیق شده بود، حاوی 461/10 میلی گرم آربوتین بوده است. با توجه به این که از 10 گرم برگ گیاه ، 1/20 میلی لیتر عصاره به طریقه سوکسله تهیه شد و از 3/0 میلی لیتر آن جهت تهیه محلول تزریقی استفاده شد، مقدار آربوتین در 1/20 میلی لیتر برابر با 8997/700 میلی گرم خواهد بود. بنابراین میزان آربوتین در گیاه  009/7 درصد ارزیابی شد.

هـ) محاسبه مقدارآربوتین از روش‌اسپکتروفتومتری: با توجه به شدت جذب محلول 1درصد آربوتین در سل 1 سانتی‌متری ( 648 = (E  ₁^1% ، درصد کل ترکیبات هیدروکینونی بر اساس آربوتین مطابق فرمول زیر قابل محاسبه خواهد بود.این نکته را باید در نظر داشت که در این روش| غلظت تمام ترکیبات هیدروکینونی براساس آربوتین اندازه گیری می شود؛ اما در روش HPLC تنها میزان آربوتین| اندازه گیری می شود.

E  ₁^1%*b /E 5000 = E ₁^1%*5*b /250*E*100 = درصد آربوتین

E= مقدار جذب محلول نمونه مورد آزمایش

E ₁^1% = شدت جذب محلول 1 درصد آربوتین در سل 1 سانتی متری

=b مقدار وزن نمونه پودر گیاه برحسب گرم.

در صورتی که بجای E ₁^1%  و b | مقادیر عددی مربوط به آن‌ها را در فرمول فوق قرار دهیم، حاصل| عبارت خواهد بود از (8).

E * 3/19  = درصد آربوتین

باتوجه به این‌که درگیاه تلکا 365/0=E است، مقدار آربوتین حاصل از تلکا 0445/7 درصد ارزیابی شد.

بحث

از آربوتین به منظور ضدعفونی کردن مجاری ادراری در عفونت‌های دستگاه ادراری استفاده می‌شود. حداکثر اثرات ضدعفونی کنندگی آن 4 –3 ساعت بعد از مصرف می‌باشد(9). نیز آربوتین| اثر آنتی‌اکسیدان و ضد آفتاب دارد و با مهار سنتز ملانین| سبب سفید کردن پوست می‌شود. بنابراین به عنوان عامل سفیدکننده در فرمولاسیون اشکال دارویی موضعی محافظ در برابر تابش‌های شدید اشعه فرابنفش به‌کار برده می‌شود. آربوتین برای چشم و پوست| حساسیت زا نمی باشد(4).

آربوتیـن قاعـده آور و دیورتیـک است. میوه‌هـای تازه جنس Pyrus در انسان در مصرف خوراکی| فعالیت ضدتوموری و فعالیت ضد جهش ژنی در برابر باکتری سالمونلا تیفی موریوم نشان داده‌اند(5).

در این ارزیابی به منظور شناسایی آربوتین در گیاه تلکا از روش‌های HPLC و TLC و برای تعیین مقدار آربوتین از روش  HPLC و اسپکتروفتومتری استفاده شده است.

میـزان آربوتیــن گــزارش شــده در بـرگ گیــاه Arctostaphilos uva-ursi  4 تا 15 درصد، در بــرگ گیاه Pyrus piraster 38/3 درصد، در بـرگ گیــاه Pyrus amigdaliformis 05/4 درصد، در بـرگ گیــاه Bergenia crossifolia 5/7 درصد و در بـرگ گیــاه Vaccinium vitis 7 درصد می باشد(7|3|2).

در این تحقیق ، میزان آربوتین تعیین شده در برگ گیاه Pyrus  biossieriana  01/7 % می باشد.

با توجه به خصوصیات ذکر شده| گیاه تلکا با 01/7 درصد آربوتین| نسبت به سایر گیاهان حاوی آ‌ربوتین که مقادیر کم‌تری از آن را دارا هستند ، دارای ارزش و اهمیت ویژه ای است.

مقدار آربوتین در برگ گیاه تلکا در دو روش اسپکتروفتومتری و HPLC با هم مقایسه شد که مشابه هم بود. در روش HPLC مقدار آربوتین معادل 009/7 درصد و در روش‌اسپکتروفتومتری معادل0445/7 درصد تعیین شد. با توجه به دقت زیاد روش HPLC و این‌که در روش اسپکتروفتومتری| سایر فنل گلیکوزیدها نیز تعیین مقدار می‎شوند، میزان 009/7 درصد آربوتین بیش‌تر مورد تایید می باشد.

فهرست منابع

1.                ثابتی حبیب الله. جنگلها، درختان و درختچه‌های ایران  انتشارات دانشگاه یزد،1373، صفحه 562-561.

2.                Petricic J| Apostolski R| Srepel B. The leaf of the wild pear-tree as an arbutinic herb. Farmacevtski Vestnik Ljubljana Journal| 1981; 32(2): 107-110.

3.                Lubsandorzhieva P.B| Zhigzhitov B.S| Dargaeva Zh.G| Nagaslaeva L.A. Chromatospectrophotometric determination of arbutin in the leaves of Bergenia crassifolia (L.). Pharmaceutical Chemistry Journal| 2000; 34(5): pp 261-264.

4.                Couteau C| Coifard L. Photostability determination of arbutin| a vegetable whitening agent. Farmaco Journal| 2000; 55(5): 410-413.

5.                Bilia A.R| Rubio M| Alvarez M| Morelli I| Gonzalez M. New benzyl alcohol glycosides from Pyrus bourgaeana. Planta Medica Journal| 1994; 60(6): 569-571

6.                Sticher O| Soldati F| Lehmann D. HPLC separation and quantitive determination of arbutin| methyl arbutin| hydroquinone and hydroquinone monomethylether in Arctostaphylos| Bergenia| Callena and Vaccinium species. Planta Medica Journal| 1994; 60(6): 569-571.

7.                Wagner H| Bladt S. Drugs containing arbutin| salicin and salycoil derivatives. In Plant Drug Analysis. 2^th ed. Berlin: Springer. 1996: 247-253.

8.                قاسمی دهکردی نصرالله، طالب امیرمهدی. استخراج، شناسایی و تعیین مقدار ترکیبات موجود در گیاهان دارویی شاخص، اصفهان : انتشارات چوگان با همکاری دانشگاه علوم پزشکی، 1380 ، صفحه 88-85 .

9.                Stambergova A| Supcikova M| Leifetova I. Evaluation of phenolic substances in Arctostaphylos uva ursi| determination of arbutin| methylarbutin and hydroquinone in the leaves by HPLC.Ceska-a-slovenska- farmacie| 1985; 34(5): 179-182.

10.               Harborne J.B. Phenolic compounds. In Phytochemical methods| 3^th ed| London: Chapman and Hall. 1998: 46-47.

11.               Schieber A| Keller P| Carle R. Determination of phrnolic asids and flavonoids of apple and pear by HPLC. Journal of Chromatography| 2001; 910(2): 265-273.

12.               Sun H| Wang X| Huang R| Yuan C. Determinatiom of arbutin in the herbs of Vaccinium vitis-idea by HPLC. Zhongguo-zhong-yao-za-zhi| 1997; 22(9): 555.